A investigação de paternidade é uma ação judicial que pode ser ajuizada quando existe a recusa do suposto pai a submeter-se ao exame de DNA ou, havendo resultado positivo deste exame, este se recusa a reconhecer o menor. Nos casos de investigação de paternidade o pedido vem do suposto filho, pois este deseja sanar a dúvida.

O que difere da Ação Negatória de Paternidade, pois aqui, tem-se a dúvida partindo do pai, que ajuíza o procedimento por meio de advogado, a fim de confirmar se o indivíduo é seu filho. Apenas o suposto genitor pode ingressar com este pedido, pois somente ele poderá rejeitar a paternidade caso tenha registrado a criança que não é sua biologicamente. Este sujeito possui o direito de buscar a nulidade do reconhecimento voluntário feito.

Na ação judicial de Negatória de Paternidade será necessário que se demonstre a falta de vínculo de afeto para que não seja caracterizada a 'paternidade socioafetiva', que é a relação de afeto entre o suposto genitor e o filho, que se sobrepõe sobre o vínculo biológico e que pode servir de argumento quando um pai "não biológico", deseja registrar uma criança. Ressalta-se que o comportamento negativo do filho não induz a presunção absoluta da inexistência da paternidade, porém, o comportamento negativo do pai, ao negar-se em realizar o DNA, induz à presunção de paternidade. Existe também a possibilidade de o genitor reconhecer a paternidade da criança de forma voluntária, sem necessidade de qualquer ação para tanto, sendo o procedimento realizado em Cartório de Registro Civil.

O Tribunal de Justiça de São Paulo (TJSP) manteve sentença de Primeiro Grau que condenou um pai a pagar R$ 7 mil por danos morais à filha, "que sofreu humilhação e vergonha desnecessárias" em ação negatória de paternidade. Isto porque, ele era o verdadeiro pai. Segundo os autos, o pai, meses após o nascimento de sua filha, interpôs ação negatória de paternidade, mas teria concordado em reconhecê-la, dispensando o exame de DNA. Decorridos mais de dez anos, o pai promoveu nova ação idêntica, quando o exame foi realizado e confirmada a relação de paternidade.